Świecące endosomy w żywej komórce

Od jakiegoś czasu zjawiam się na konwentach z prelekcją o białkach fluorescencyjnych. Jest to technika, która pozwala na zaobserwowanie w komórkach na żywo różnych zjawisk, które przez większość historii biologii molekularnej widywaliśmy jedynie w komórkach i tkankach utrwalonych, a zatem zupełnie martwych. Na śmierć.

Aby to zrobić, najpierw trzeba dokonać transfekcji - czyli przejściowego zmodyfikowania genetycznego komórek, które chcemy obserwować.
Brzmi jak początek filmu katastroficznego?
Otóż dla biologa molekularnego jest to technika równie powszechna, jak użycie młotka i o niebo bezpieczniejsza, bo młotkiem można się uderzyć w palec, a zmodyfikowana genetycznie komórka ssacza na szalce nadal jest tylko komórką ssaczą na szalce i nic nikomu zrobić nie może.

Zazwyczaj wcale nie grzebiemy do tego w genomie komórki, tylko wprowadzamy do niej plazmidy. Plazmid to takie małe kółko z DNA, używane zwykle przez bakterie jako podręczny dodatek do genomu. Kodują sobie na nich oporności na różne antybiotyki i handlują nimi miedzy sobą nawzajem. Stąd tak prędko rozpowszechniają się w przyrodzie bakterie antybiotykooporne.

Otóż plazmidy można spreparować tak, żeby mogła ich używać komórka ssacza i podać jej w taki sposób, aby je pobrała - na przykład za pomocą odczynników takich, jak lipofektamina. Ssacze komórki często gubią plazmid w ciągu kilku dni albo od niego umierają, ale nas to nie interesuje, bo chcemy tylko je oglądać następnego dnia, a nie robić coś z nimi dalej (gdybyśmy chcieli dalej, są i takie techniki).
1. Możemy sprawić, że będzie produkowała białko, jakiego zwykle nie produkuje. Na przykład takie, które zaburza jakieś funkcje w komórce. Albo przywraca jej funkcje, które straciła. Ma to mnogość zastosowań badawczych.
2. Albo produkowała takie, jak zwykle, ale w nadmiarze. Potraktować ją jak mini reaktor do wytwarzania tego białka, żeby je badać.
3. Albo produkowała takie, jak zwykle… ale zmodyfikowane tak, aby świeciło. I obserwować jego zachowanie pod mikroskopem.
Etc…
Jakiś czas temu za odkrycie świecącego białka GFP przyznano nagrodę Nobla. Gazety rozpisywały się na ten temat, ale konia z rzędem temu, kto na podstawie fotek świecącej meduzy wywnioskował, do czego my tych białek używamy. Bo niekoniecznie do tego, żeby mieć fajne świecące myszy. I nie, one nie świecą w ciemnościach - emitują światło pod wpływem światła, z przesunięciem chromatycznym (innego koloru).
Po szczegóły zapraszam na moją prelekcję. Albo napiszę o tym artykuł, czy co.

I co ja z tym robię?

Otóż podaję komórkom takie plazmidy, żeby można było obserwować endosomy.
O ile przeważnie wiemy, co to jest jądro komórkowe czy też mitochondria, nie jestem pewna, czy endosomy znajdują się we współczesnym programie nauki biologii. Są to pęcherzyki odpowiedzialne za transport rozmaitych białek, mRNA i tak dalej w komórce, czasem także degradację.
Ich nieprawidłowe działanie obserwowano w wielu chorobach neurodegeneracyjnych - takich, jak choroba Alzheimera, Parkinsona, ALS (i pewnie wiele innych, ale ja jestem naturalnie skrzywiona w stronę neurobiologii).
Oto endosomy. Żywe. Małe kulki latające sobie po szczurzym fibroblaście. Tenże fibroblast siedzi sobie na szalce ze szklanym denkiem, w towarzystwie kilkudziesięciu tysięcy innych, zalany pożywką.



W kolorze zielonym widzimy hybrydowe białko EGFP-Rab5.
EGFP to zielone białko fluorescencyjne, wersja ulepszona. Rab5 to małe białko występujące we wczesnych endosomach.
W kolorze czerwonym widzimy białko Tag-RFP-EEA1. Tag-RFP to nowoczesne czerwone białko fluorescencyjne.
EEA1 to inne białko występujące we wczesnych endosomach, które wiąże się z Rab5. Widać, że występują razem.

Kolory na filmie są nadane cyfrowo i odzwierciedlają te prawdziwe tylko dlatego, że tak chcę. Oryginalny film z kamery jest zawsze czarno-biały - odbiera ona i amplifikuje światło - a nagranie zrobiono w dwóch kanałach. Równie dobrze jeden mogłabym pokolorować na fioletowo, a drugi na żółto. Ale tak jest łatwiej.
Nie wiem, jak wam, ale mnie się tam podobają.